浙江大学刘旭、匡翠方课题组:非线性焦点调制显微方法实现快速低光强超分辨成像
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浙江大学刘旭、匡翠方教授团队发明了非线性焦点调制显微方法(NFOMM)。他们从频域角度考虑光学显微成像,通过在传统共聚焦点扫描显微成像系统中加入相位调制元件,利用饱和光束照明下的非线性效应,获取了成像样品的更多细节信息,实现了低光强下(毫瓦级别)60 nm分辨率的超分辨成像。
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显微技术的发展在近一个世纪的时间里突飞猛进,在1953年、1986年和2014年三次获得了诺贝尔奖,极大地促进了生物医学、物理和化学等领域的发展。
图1 光学显微成像的重要发展历程
在传统显微方法中,以共聚焦为代表的点扫描显微方法相比宽场显微方法因为其层切能力强(三维成像分辨率高)、成像深度大、信噪比高等诸多优点而被广泛应用在材料和细胞观测中。然而衍射极限阻碍了传统显微方法观察更微小的结构,限制了点扫描显微方法成像性能的进一步提升。
在过去的两个世纪里,诞生了众多点扫描超分辨显微方法,如通过缩小激发光斑的受激辐射损耗超高分辨率显微镜(STED),通过减小接收小孔大小的Zeiss Airyscan等。他们无一例外地遵循着缩小空域激发光斑的思路,而根据这一思路的探索具有超分辨系统昂贵复杂,照明光强高(瓦级别)等不足。
最近,该课题组抛弃了主流的从空域缩小聚焦光斑的探索思路而转向更加泛化的频域调制机理,即将成像系统考虑成低通滤波系统,在实验中尽可能做到:1. 将样品更多的高频分量移动到可被显微镜接收到的低频范围内;2. 对该过程进行建模,然后通过优化算法和前向模型解调出这些高频分量的细节信息。如图2所示,课题组在共聚焦系统照明光路中对光束进行一系列的相位调制,同时控制光强使得荧光分子发光饱和,从而产生大量的非线性高频分量,将获得的多张采集图像经过多视角重建算法处理,得到超分辨显微结果。在验证性实验中,NFOMM取得了4倍于共聚焦显微成像系统的分辨率提升。
图2 NFOMM基本原理
目前,该技术在荧光纳米颗粒、细节大小为80~100 nm的细胞核孔、细节大小为数十纳米的波形蛋白和细胞微管等多类亚波长样品上均得到验证,显示了其普适性强、使用方便的优点。图3所示为使用共聚焦方法与NFOMM方法观察细胞微管和波形蛋白双色样品的对比效果图,可以看出NFOMM方法明显提高了分辨率。NFOMM的简便、低成本以及与普通共聚焦系统的高度兼容性使其在生物医学和材料学等重要领域具有广阔的应用前景。该课题组期待NFOMM 能作为附件,对于现有广泛应用的共聚焦系统进行换代升级,在低成本下实现快速超分辨显微成像。同时NFOMM的计算成像思路,也为下一代超分辨光学显微镜提供了新的设计理念。
图3 共聚焦方法与NFOMM方法观察细胞微管和波形蛋白双色样品的对比实验效果图
此项成果近期以Nonlinear focal modulation microscopy为题发表在上并当选为2018年第19期封面文章。论文第一作者为浙江大学赵光远和郑程硕士,通讯作者为浙江大学匡翠方和刘旭教授。合作单位包括香港中文大学和美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校。此工作得到了973项目、国家自然科学基金委重大仪器等项目的资助。
https://journals.aps.org/prl/abstract/10.1103/PhysRevLett.120.193901
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